Поделиться статьей

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

12.06.2025
Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является основой многих методов молекулярной биологии и молекулярной генетики. Всего за несколько часов с помощью ПЦР можно создать миллион копий одной молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК), что позволяет получить достаточно материала для многочисленных клинических и исследовательских целей.

Справочная информация
Терминология
  • Анализ нуклеиновых кислот (NAT - Nucleic acid testing)
    • В широком смысле относится к любому тестированию или диагностическому анализу, который предполагает исследование нуклеиновых кислот (т. е. ДНК, РНК), в отличие от серологического анализа на антиген. Обычно применяется при тестировании на инфекционные заболевания. На практике в большинстве исследований с применением метода NAT используется ПЦР для амплификации нуклеиновой кислоты целевого организма.
  • ПЦР
    • Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - общий термин, обозначающий метод амплификации* определенных сегментов ДНК путем последовательных циклов репликации ДНК с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и набора праймеров, определяющих амплифицируемый сегмент ДНК.
  • ОТ-ПЦР (RT-PCR)
    • ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) используется для превращения исходной матрицы РНК в комплементарную ДНК (кДНК), которая затем может быть амплифицирована стандартными методами ПЦР. Многие вирусные геномы основаны на РНК, а не на ДНК, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), поэтому ОТ-ПЦР применяется для амплификации таких РНК-содержащих организмов.
  • кПЦР (qPCR)
    • Количественная ПЦР (полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-time quantitative PCR), также называемая ПЦР-РВ, кПЦР, RT-qPCR) - это высокочувствительный метод количественного определения абсолютного или относительного количества определенной последовательности нуклеиновых кислот. В кПЦР флуоресцентный зонд, включенный в реакцию ПЦР, может гибридизироваться с целевой последовательностью, а накопление флуоресцентно-меченых продуктов ПЦР измеряется непосредственно, без пост-ПЦР модификаций. Подробная информация о зонде и описание методики приведены ниже.
    • Из-за путаницы, вызванной двумя значениями термина RT (реальное время - real-time и обратная транскриптаза – reverse transcriptase), было предложено использовать термин qPCR для обозначения количественной ПЦР в реальном времени, а RT-PCR - для обозначения ПЦР с обратной транскрипцией, но это соглашение не было повсеместно принято [1].
    • Наиболее часто кПЦР (qPCR) в клинических целях используется с целью количественного определения вирусной нагрузки (например, для РНК SARS-CoV-2), определения числа копий ДНК, измерения уровня экспрессии генов и мониторинга минимальной остаточной болезни после лечения гематологических злокачественных новообразований. Соответствующие данные представлены в отдельных обзорах.
  • Пороговое число циклов
    • Пороговое число циклов (Ct) - это значение, используемое в кПЦР для оценки количества ДНК в образце. Ct определяется как число циклов ПЦР, необходимое для того, чтобы флуоресцентный сигнал, возникающий в ходе реакции, превысил заданный порог.
    • В нормальных условиях интенсивность флуоресценции увеличивается с каждым циклом qPCR, пропорционально исходному количеству ДНК. Чем меньше ДНК в образце изначально, тем больше циклов требуется, чтобы сигнал достиг порогового уровня. Таким образом, высокий Ct указывает на низкое исходное количество ДНК, а низкий Ct - на большее количество ДНК в исходном материале (например, большую вирусную нагрузку при ВИЧ или SARS-CoV-2). Порог калибруется для каждого конкретного анализа кПЦР и обычно устанавливается на уровне, кратно превышающем уровень фоновой флуоресценции (т. е. шума).
  • Мультиплексная ПЦР
    • Метод ПЦР, который позволяет одновременно анализировать две и более различных нуклеиновых кислот в одном образце. Мультиплексная ПЦР используется для одновременного тестирования образца на несколько последовательностей (например, разные гены, варианты ДНК или штаммы микроорганизмов). Мультиплексная ПЦР часто используется для микробиологического исследования материала из дыхательных путей у пациента с подозрением на респираторную инфекцию или образца спинномозговой жидкости (СМЖ) для определения возможных патогенов у пациента с подозрением на менингит.
  • Цифровая ПЦР
    • Цифровая ПЦР (цПЦР, dPCR), также известная как капельная цифровая ПЦР, является модификацией традиционной ПЦР, предназначенной для количественного анализа образца без необходимости многократных циклов амплификации.
    • Основной принцип цифровой ПЦР заключается в том, что образец разделяется (с помощью сложных микрофлюидных технологий) на отдельные маленькие порции (аликвоты), каждая из которых содержит очень небольшое количество нуклеиновых кислот пациента (в среднем – одну молекулу). Затем в каждой порции проводится ПЦР, в результате чего получается бинарный ответ: целевая нуклеиновая кислота либо присутствует, либо отсутствует. Далее применяется математическое моделирование (основанное на распределении Пуассона), что позволяет оценить исходное количество целевой нуклеиновой кислоты без необходимости проведения нескольких циклов амплификации, как это требуется в кПЦР. Таким образом, измеренное количество в цПЦР считается абсолютным показателем, а не относительным, как в традиционной ПЦР (которая оценивается по пороговому значению относительно стандартного образца). цПЦР применяется в различных клинических ситуациях, например, при диагностике инфекционных и онкологических заболеваний [2,3].
  • Генотипирование
    • Генотипирование - это процесс определения генотипа (набора аллелей) конкретного индивидуума в определенном участке генома. Большинство типов генетической вариабельности можно определить с помощью методов ПЦР, включая микросателлитные повторы, однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism - SNP), варианты инсерции/делеции (инделы), и некоторые структурные вариации, такие как вариации числа копий генов.
  • Чувствительность/предел обнаружения (LOD - limitofdetection)
    • ПЦР обладает высокой аналитической чувствительностью (способностью обнаруживать крайне низкие уровни нуклеиновых кислот); LOD используется для определения минимального количества молекул нуклеиновых кислот, которые могут быть достоверно выявлены в ПЦР-реакции [1]. Аналитическую чувствительность не следует путать с клинической чувствительностью, которая отражает долю пациентов с заболеванием, у которых тест показывает положительный результат.

* Амплификация это процесс многократного копирования (увеличения количества) определенного участка ДНК или РНК.

Теоретические основы метода ПЦР
Принцип работы

Подобно репликации ДНК, происходящей во время деления клетки, ПЦР быстро амплифицирует целевые участки ДНК, разделяя две нити спирали ДНК и используя ДНК-полимеразу для репликации обеих нитей.

Термостабильная полимераза

Главное отличие ПЦР от предыдущих методов амплификации ДНК заключается в том, что используемая ДНК-полимераза является термостабильной. Впервые она была обнаружена у бактерий, обитающих в горячих источниках и гидротермальных вентиляционных отверстиях. Эта полимераза способна выдерживать многократные циклы воздействия чрезвычайно высоких температур (95°C), не подвергаясь денатурации [4]; оптимально она функционирует при температуре около 70°C [5].

Высокая температура необходима для того, чтобы «расплавить» ДНК на отдельные смысловые и антисмысловые цепи, чтобы полимераза могла связывать и удлинять новые цепи ДНК. Поскольку полимераза выдерживает высокие температуры, необходимые для расплавления ДНК, можно повторять несколько циклов плавления ДНК с последующей полимеризацией ДНК без необходимости открывать пробирку и пополнять реакционную смесь свежей полимеразой. В результате амплификация ДНК может быть автоматизирована. Это технологическое достижение позволило проводить быстрые циклы амплификации (от 3 до 5 минут) с высокой точностью, что привело к экспоненциальному увеличению количества копий целевой ДНК.

  • Taq
    • Стандартным ферментом, используемым в большинстве ПЦР-методов, является ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus (Thermophilus) aquaticus (Taq). Коэффициент ошибок (число неправильно вставленных нуклеотидов на один нуклеотид за цикл) для стандартной Taq-полимеразы составляет примерно 1 ошибка на 100 000 оснований (1 из 10⁵). Это считается приемлемым для большинства клинических диагностических тестов, так как такой уровень ошибок не влияет на точность анализа.
  • Pfu
    • Высокоточные полимеразы с функцией исправления ошибок in vitro, такие как фермент, полученный из архебактерии Pyrococcusfuriosus (Pfu), имеют частоту ошибок, примерно в 10 раз ниже (1 из 10⁶). Эти ферменты используются в методах, требующих высокой точности синтеза ДНК, например при клонировании генов [6].

Матрица ДНК (DNA template)

Длина амплифицируемого участка ДНК может варьироваться от примерно 50 нуклеотидов до 10 килобаз (кб). Благодаря экспоненциальной амплификации исходное количество ДНК может быть чрезвычайно малым, вплоть до одной молекулы ДНК.

Праймеры

Ключом к точному копированию определенного участка ДНК является правильный подбор пары «ПЦР-праймеров» – коротких последовательностей ДНК, комплементарных смысловой и антисмысловой цепям целевой ДНК. Эти праймеры фланкируют (обрамляют) амплифицируемый участок с обеих сторон. После связывания праймеров с комплементарной последовательностью ДНК, образуется двухцепочечный комплекс (дуплекс), который служит стартовой точкой для работы ДНК-полимеразы. Фермент удлиняет праймер, используя матрицу ДНК, что приводит к амплификации целевого участка ДНК.

Основные источники ошибок в ПЦР связаны с неправильным дизайном праймеров и контаминацией ДНК (загрязнением образца посторонними нуклеиновыми кислотами).

Влияние

С момента своего появления ПЦР оказала огромное влияние на биомедицинские и клинические исследования [7,8]. ПЦР относительно недорога и достаточно проста для проведения в большинстве лабораторий молекулярной биологии. За ее открытие Кэри Маллинз был удостоен Нобелевской премии по химии в 1993 году [9].

Выбор уникальных ДНК-последовательностей для амплификации

Для успешного проведения ПЦР требуется разработка высокоточных праймеров, направленных на определенные последовательности ДНК. Хотя длина человеческого генома очень велика (3 млрд оснований), для определения уникальной последовательности в геноме достаточно относительно небольшого количества оснований. Согласно теории вероятностей, ожидаемое число встречаемости заданной последовательности длиной N оснований в человеческом геноме можно выразить формулой: (3x109) x 1/4N

В приведенном выше уравнении 1/4N - это вероятность появления заданной последовательности длиной N оснований, а константа 3x109 - это количество оснований в геноме человека.

Таким образом, вероятность случайного появления ПЦР-праймеров длиной 20 и 25 нуклеотидов оценивается в 0,003 и 0,000003 на геном, соответственно. Учитывая, что для успешного проведения ПЦР оба праймера должны локализоваться в относительно небольшом геномном регионе в определенной ориентации друг к другу (на противоположных цепях ДНК, «смотря» друг на друга), вероятность амплификации более чем одного участка ДНК чрезвычайно мала.

Для быстрого подбора праймеров на основе известной последовательности генома доступны автоматизированные алгоритмы выравнивания последовательностей; они также могут использоваться для проверки того, приведет ли пара праймеров к амплификации уникальной последовательности в геноме, а также для расчета точной длины ожидаемого ампликона [10].

Процесс проведения ПЦР
Реакционная смесь для ПЦР
Что находится в пробирке

Реакция ПЦР проходит в одной пробирке. В условиях высокопроизводительного ПЦР-тестирования можно одновременно выполнять несколько реакций, используя планшеты с несколькими маленькими лунками.

Реакционная смесь для ПЦР содержит следующие компоненты:

  • Один или несколько образцов ДНК (или РНК), подлежащих амплификации («матрица»), часто геномная ДНК.
  • Короткие олигонуклеотидные праймеры (обычно длиной от 21 до 23 оснований), фланкирующие и определяющие область амплификации ДНК.
  • Дезоксинуклеотидтрифосфаты (основания ДНК) - строительные блоки для удлинения цепи ДНК.
  • Термостабильная ДНК-полимераза (фермент, который удлиняет праймеры при наличии соответствующей матрицы).
  • Буферный раствор, поддерживающий оптимальный уровень pH для работы ДНК-полимеразы.
  • В реакциях количественной ПЦР (кПЦР) - флуоресцентный зонд.
Флуоресцентные зонды для кПЦР

В кПЦР флуоресцентный зонд используется для определения количества амплифицированной ДНК в каждом цикле. Количество амплифицированной ДНК коррелирует с количеством исходного материала в образце. Флуоресценция очень чувствительна и может быть использована для обнаружения небольшого количества ДНК в смеси.

Каждый зонд уникален для каждой конкретной целевой последовательности ДНК. Зонды предназначены для связывания с участком амплифицированной ДНК между двумя фланкирующими ПЦР-праймерами (но не накладываясь на них). Количество связавшихся зондов пропорционально количеству образовавшейся ДНК в каждом цикле ПЦР, которое, в свою очередь, пропорционально количеству исходного материала в образце.

Благодаря своей конструкции, зонд флюоресцирует только при связывании с целевой ДНК, но не в свободном состоянии в реакционной смеси. Флуоресцентный репортерный краситель расположен на 5' конце зонда, а на 3' конце зонда расположен гаситель флюоресценции. Пока гаситель находится вблизи репортера, он блокирует флюоресценцию. Когда зонд находится в свободном состоянии в растворе, гаситель блокирует флуоресценцию. Когда зонд связывается с целевой ДНК, он становится субстратом для ДНК-полимеразы, участвующей в реакции ПЦР. ДНК-полимераза обладает 3’-экзонуклеазной активностью, которая позволяет удалить гаситель и высвободить репортер, позволяя ему флуоресцировать. Вследствие экспоненциального характера ПЦР, сигнал флуоресценции увеличивается пропорционально количеству образовавшегося продукта ПЦР до достижения плато. Такой тип зондов для кПЦР также называют «гидролизными зондами» [8].

Количественная оценка осуществляется путем сравнения числа циклов, при которых образец пациента достигает заданного уровня флуоресценции, со стандартизированной кривой контрольного образца, что позволяет определить число копий в начале реакции.

Аппарат

Эту смесь можно поместить в ПЦР-термоциклер, который заранее запрограммирован на оптимальное время цикла реакции и температуру для амплификации интересующей последовательности ДНК.

При использовании в большинстве клинических случаев, такие аппараты просты в эксплуатации и занимают мало места на лабораторном столе.

Контрольные образцы

Для обеспечения точности и устранения возможных ошибок необходимо использовать соответствующие положительные и отрицательные контрольные образцы. Поскольку ПЦР обладает высокой чувствительностью и способна амплифицировать даже минимальные количества ДНК, особенно важен отрицательный контроль, для того, чтобы убедиться, что реагенты в реакционной смеси не загрязнены ДНК людей, проводящих ПЦР-реакцию, оборудованием, используемым для пипетирования или хранения реагентов, либо из окружающей среды [11].

Этапы процесса ПЦР

После сборки реакционной смеси три основных этапа реакции повторяются 30–40 раз.

  • Денатурация
    • Исходный материал (обычно ДНК из образца пациента) нагревают до 95°C для денатурации двухцепочечной ДНК, что приводит к разделению её на одиночные цепи.
  • Отжиг
    • Смесь охлаждается до температуры чуть ниже прогнозируемой температуры плавления праймеров, что приводит к их связыванию с одноцепочечными матричными ДНК. Термостабильная ДНК-полимераза может присоединяться к 3’-концу праймеров.
  • Элонгация
    • Температура повышается до температуры, при которой термостабильная ДНК-полимераза инициирует удлинение цепи. Типичная температура элонгации составляет примерно 70-72°C. Полимераза добавляет свободные нуклеотиды к 3' концам праймеров, используя матричную ДНК, чтобы определить, какое основание добавлять следующим. К растущей ПЦР-продукции добавляются комплементарные основания матричной последовательности (A комплементарен T, C комплементарен G).
    • Элонгация продолжается около минуты и завершается повышением температуры до 95°C, что приводит к разделению цепей (денатурации), для повторного запуска цикла.
    • Амплификация происходит экспоненциально. Количество потенциальных мишеней (матриц) для отжига праймеров удваивается с каждым циклом ПЦР, поскольку амплифицированные последовательности, полученные в одном цикле, могут служить матрицами для последующих циклов.

Если исходным материалом является РНК (например, из вируса), РНК необходимо сначала транскрибировать с помощью обратной транскриптазы, чтобы создать матрицу ДНК. Это называется ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-PCR).

Дизайн праймеров

Праймеры должны быть тщательно спроектированы, чтобы обеспечивать амплификацию уникальной последовательности ДНК. Для этого необходимо, чтобы праймеры:

  • Находились на разумном расстоянии друг от друга на смысловой и антисмысловой нитях
  • Распознавали только одну уникальную последовательность ДНК
  • Обладали схожими физико-химическими характеристиками, например сходным содержанием GC-оснований, которое влияет на температуру плавления.
  • При тестировании на инфекционные заболевания праймеры не должны амплифицировать ДНК хозяина.

Программное обеспечение для подбора праймеров и расчета температур отжига доступно в свободном доступе онлайн [12].

Источники и количество матричной ДНК или РНК

Практически любой источник ДНК или РНК может быть использован для ПЦР.

  • Физиологические жидкости и выделения, такие как слюна, мокрота, отделяемое из носа, спинномозговая жидкость (СМЖ), кровь или плазма.
  • Образцы тканей и клеточные материалы, такие как клетки крови, буккальные соскобы, образцы, полученные при проведении бронхоальвеолярного лаважа, свежие биопсийные образцы и архивированные клеточные линии.
  • Архивированные образцы тканей, включая ткани, обработанные формальдегидом или зафиксированные в парафине.

В качестве матрицы можно взять всего одну молекулу ДНК и создать десятки миллионов копий. Если реакция начинается с двух копий, то теоретически после N циклов можно получить 2ᴺ копий.

Однако качество образца ДНК существенно влияет на успех реакции:

  • Сильно фрагментированная или деградированная ДНК может привести к аллельному выпадению (селективной амплификации только одного аллеля в гетерозиготном локусе) или ложноотрицательным результатам.
  • Примеси в образце могут препятствовать амплификации. Это особенно важно при кПЦР, поскольку ингибиторы снижают эффективность реакции.
Контрольные образцы

Положительный и отрицательный контроль

Технические положительные и отрицательные контрольные реакции должны выполняться во всех ПЦР-анализах для подтверждения:

  • Нормальной работы теста, при которой амплификация матрицы происходит в присутствии целевой последовательности ДНК (положительный контроль).
  • Отсутствия загрязнения реагентов посторонней ДНК (отрицательный контроль, также называемый контролем без матрицы).

Условия проведения контрольных образцов должны соответствовать условиям для клинических образцов. Матрица положительного контрольного образца должна быть подготовлена так же, как исследуемый образец, при этом ДНК положительного контрольного образца обычно экстрагируется по тому же протоколу и из того же исходного материала, что и исследуемый образец. В отрицательном контрольном образце используются все компоненты ПЦР-реакции, но вместо ДНК-матрицы добавляется вода. Поскольку ПЦР обладает экстремальной аналитической чувствительностью к определению ДНК, даже небольшие количества посторонней ДНК могут привести к ложноположительному результату. Чтобы минимизировать этот риск, в диагностических лабораториях ПЦР часто организуют отдельные зоны для до- и пост-амплификационных этапов, размещая их в разных помещениях.

Специфические контрольные образцы

Дополнительно могут потребоваться контрольные образцы, специфичные для конкретного анализа. Например, при обследовании родителя на наличие варианта последовательности, выявленного у его потомка, в качестве положительного контрольного образца для ПЦР и секвенирования может использоваться ДНК ребенка, тогда как исследуемым образцом будет ДНК родителя.

Результаты

Результаты ПЦР могут быть представлены как в бинарном (положительном или отрицательном), так и в количественном виде:

  • В некоторых случаях (например, при скрининге ДНК на наличие или отсутствие определенных микроорганизмов) результаты сообщаются как «положительный/обнаружен» или «отрицательный/не обнаружен».
  • Количественные ПЦР-анализы используются для измерения количества нуклеиновых кислот (например, для определения вирусной нагрузки). В этом случае полученные значения порогового числа циклов (Ct) обычно конвертируются в клинически значимые показатели (вирусную нагрузку, количество копий ДНК). Для этого значения Ct сравнивают с контрольными образцами с известной концентрацией, которые анализируются параллельно с клиническими образцами. Определение Ct дано выше; примеры приведены ниже.
Преимущества и недостатки
Преимущества ПЦР
  • Скорость
    • Время выполнения некоторых анализов составляет менее одного часа [8]. В других случаях, например, при крупномасштабном коммерческом тестировании, процесс может занять от двух до четырех часов, в зависимости от времени, необходимого для подготовки образца. Реакции в одной пробирке позволяют быстрее обрабатывать образцы и проводить анализы в пунктах оказания медицинской помощи.
    • Для диагностики инфекционных заболеваний ПЦР и другие тесты на нуклеиновые кислоты значительно быстрее, чем культуральные методы, которые могут выполняться от нескольких дней до недель.
  • Предел обнаружения
    • ПЦР способна амплифицировать ДНК из одной клетки или одной молекулы ДНК, что делает ее чрезвычайно чувствительной. Этого уровня чувствительности достаточно для применения в преимплантационном генетическом тестировании эмбрионов или для выявления очень низких уровней инфекционного вируса. Эта характеристика называется высокой аналитической чувствительностью.
  • Низкая стоимость и простота использования
    • Стоимость низкая, поскольку компоненты реакционной смеси недороги, а участие человека в процессе может быть сведено к минимуму, особенно при автоматизации. Основные расходы - это стоимость ПЦР-аппарата и затраты, связанные со сбором образцов и поддержанием стерильных условий в лаборатории.
Недостатки ПЦР

ПЦР имеет недостатки, которые стоит учитывать [8]:

  • Невозможность выявления новых вариантов ДНК или новых микроорганизмов
    • Для правильного подбора праймеров необходимо знать нуклеотидную последовательность исследуемого региона. Это ограничивает использование ПЦР при попытках выделения и амплификации новых генов. Неизвестные ранее организмы с уникальными последовательностями могут не обнаруживаться, а если их последовательности похожи на уже известные микроорганизмы, они могут быть неверно классифицированы. Для выявления новых последовательностей требуется прямое секвенирование, включая секвенирование нового поколения (NGS).
  • Контаминация
    • Из-за высокой чувствительности ПЦР, всегда существует риск загрязнения посторонней ДНК, что особенно критично при тестировании на инфекционные заболевания, если патогенные организмы присутствуют в помещении лаборатории.
  • Ошибки при амплификации длинных целевых последовательностей
    • Несмотря на то, что существуют методы ПЦР длинных фрагментов (long-range) для амплификации фрагментов ДНК длиной от 5 до 10 килобаз(кб), они подвержены более высокой частоте ошибок и менее надежны. Кроме того, крупные вариации числа копий, такие как делеции, охватывающие амплифицируемую область, не могут быть обнаружены, поскольку будет амплифицироваться только неизмененный аллель.
  • Неспособность отличить живые патогены от мертвых
    • ПЦР высокочувствительна для обнаружения ДНК или РНК патогена, но она не может отличить, является ли нуклеиновая кислота частью живого организма или остаточным материалом мертвого микроорганизма. Это особенно важно, поскольку фрагменты нуклеиновых кислот могут долго сохраняться после гибели патогена.
  • Сложности в выявлении редких последовательностей
    • Если одна и та же пара праймеров распознает как редкие, так и распространенные последовательности, обилие последних может затруднять обнаружение редких. Для решения этой проблемы разработаны модификации ПЦР, улучшающие обнаружение редких последовательностей [13].
Клиническое применение
Общая информация

С момента своего появления ПЦР быстро стала незаменимой в клинической практике и исследованиях.

Как и при проведении любых клинических лабораторных исследований, лаборатории, использующие ПЦР, должны быть сертифицированы в соответствии с правилами CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments).

Инфекционные заболевания
Для каких целей используется

Благодаря множеству преимуществ по сравнению с культуральными методами (время выполнения всего несколько часов против нескольких дней) и серологическими тестами (более низкий предел обнаружения, чем у серологической диагностики), ПЦР широко применяется как первичный или подтверждающий диагностический анализ для выявления многих патогенов.

ПЦР также используется для контроля ответа на терапию (например, для мониторинга вирусной нагрузки). При условии, что известна хотя бы часть нуклеотидной последовательности ДНК или РНК патогена, ПЦР может быть применена для обнаружения любой инфекции – вирусной, бактериальной, грибковой или протозойной. Разработаны эффективные протоколы экстракции нуклеиновых кислот, позволяющие адаптировать ПЦР к анализу практически любых клинических образцов, включая, включая кровь, секрет дыхательных путей, спинномозговую жидкость (СМЖ) и свежие образцы тканей. ПЦР не может использоваться для идентификации новых (ранее неизвестных) патогенов и не позволяет отличить живые патогены от остаточных нуклеиновых кислот неживых организмов.

Диагностика инфекционных заболеваний
  • COVID-19
    • ПЦР-анализы для выявления вирусной РНК SARS-CoV-2 из клинических образцов были разработаны и внедрены в практику через несколько недель после публикации последовательности SARS-CoV-2. Они регулярно используются для диагностики активной инфекции COVID-19, для подтверждения результатов иммуноферментного анализа и для выявления бессимптомной инфекции SARS-CoV-2.
  • Другие вирусы
    • Применение ПЦР-тестов для обнаружения других распространенных вирусных патогенов стало стандартной практикой. Пример – выявление вируса простого герпеса (HSV) в СМЖ. Для выявления различных вирусных инфекций в одном и том же образце были разработаны мультиплексные анализы, включающие зонды, нацеленные на различные вирусные последовательности. Примером может служить ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для выявления различных штаммов вируса гриппа в образце одного и того же пациента.
  • Бактерии и грибы
    • Методы ПЦР предложены для диагностики бактериальных и грибковых инфекций, а также определения устойчивости к антибиотикам. Для бактериальных инфекций разработано множество мультиплексных и широкоспектровых ПЦР-тестов, нацеленных на последовательность 16S рРНК, что позволяет одновременно выявлять несколько патогенов. Эти анализы могут использоваться как в качестве первичного скрининга, так и как второй этап диагностики, если посевы дали отрицательный результат.
    • В исследовании 2022 года, проведенном на 6130 клинических образцах, было выявлено, что широкоспектровая ПЦР обнаружила хотя бы один микроорганизм в 45% случаев, когда посевы гноя, отделяемого абсцесса или эмпиемы были отрицательными; дополнительное тестирование с использованием мультиплексной ПЦР, нацеленной на распространенные бактериальные патогены, повысило частоту выявления до 61% [14].
  • Другие примеры включают:
    • ESKAPE-патогены
      • Широко применяемым методом для скрининга кишечных инфекций являются мультиплексные панели на основе ПЦР (полимеразной цепной реакции), которые выявляют Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli (так называемые организмы группы ESKAPE) [15]. Магнитные частицы, связывающиеся с продуктами ПЦР, обнаруживаются с помощью магнитного резонанса. В серии случаев у госпитализированных пациентов с подозрением на бактериальный сепсис, этот тест позволил обнаружить инфекционного возбудителя за 4–8 часов, тогда как большинство посевов были готовы только через 2–3 дня [16]. По сравнению с посевом, чувствительность и специфичность ПЦР-теста составляли 90 %. ПЦР-тест также смог выявить инфекционные организмы, которые не были обнаружены при посеве крови у небольшого числа пациентов. Как отмечается в редакционной статье, этот вид тестирования является потенциально полезным дополнением к культуральному анализу для получения более быстрых результатов, но не снижает потребность в проведении посевов, поскольку ПЦР не выявляет другие организмы, кроме тестируемых, и не позволяет определить чувствительность патогена к антибиотикам [17].
    • Инфекции кровотока
      • Разработаны расширенные ПЦР-панели для выявления бактерий и грибов, включая Candida. Они успешно применяются в клинической практике для быстрой и точной диагностики инфекций кровотока у детей, даже при очень малых объемах крови [18].
Мониторинг вирусной нагрузки
  • ВИЧ (HIV)
    • ПЦР РНК, выделенной из крови, является стандартным методом мониторинга вирусной нагрузки у лиц с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Доступные коммерческие количественные ПЦР (кПЦР) в реальном времени позволяют определять абсолютное количество копий РНК ВИЧ-1 на мл плазмы.
  • Цитомегаловирусная инфекция
    • Определение вирусной нагрузки используется у реципиентов трансплантатов, получающих лечение от цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции.
  • Вирус Эпштейна-Барра
    • Вирус Эпштейна-Барра (ВЭБ) может вызывать посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (ПТ-ЛПЗ). Мониторинг вирусной нагрузки ВЭБ помогает оценить риск и разработать стратегию превентивного лечения.
  • Хронический гепатит (HBV или HCV)
    • Определение вирусной нагрузки иногда применяется у пациентов с хронической инфекцией вируса гепатита B (HBV) или гепатита C (HCV).
Скрининг донорской крови

ПЦР рутинно используется для анализа донорской крови на наличие патогенных микроорганизмов с помощью нуклеиновых кислот.

Тестирование при онкологических заболеваниях

Выявление патогенных вариантов

ПЦР применяется для анализа биопсий опухолей и образцов крови (жидкостная биопсия). Этот метод широко используется при диагностики различных видов рака, особенно в случаях, когда опухоль имеет известные патогенные варианты, влияющие на выбор терапии. В качестве примера можно привести специфические миссенс-мутации при немелкоклеточном раке легкого и метастатической меланоме.

Как и в диагностике инфекционных заболеваний, если конкретный ген или патогенный вариант неизвестен или если существует множество возможных мутаций, более предпочтительным методом будет секвенирование нового поколения (NGS).

Минимальная остаточная болезнь

Анализы на основе ПЦР рутинно используются для мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ; также называется минимальной резидуальной болезнью) при гематологических злокачественных заболеваниях.

Акушерство

ПЦР используется по различным показаниям, в числе которых:

  • Преимплантационное генетическое тестирование
    • Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) - это скрининг ранних эмбрионов in vitro (до переноса в полость матки) на наличие специфических патогенных вариантов, например мутаций, унаследованных от одного или обоих родителей. ПЦР проводится на одной клетке, биопсированной у эмбриона. Технические аспекты при проведении ПЦР на одной клетке включают предотвращение аллельного выпадения и избежание контаминации ДНК, не принадлежащей эмбриону [19].
  • Неинвазивный пренатальный тест
    • Неинвазивный пренатальный тест (НИПТ) с использованием свободной фетальной ДНК (сфДНК; также известна как внеклеточная фетальная ДНК - cell-free fetal DNA, cfDNA) в материнской крови может использоваться для выявления патогенных вариантов или других клинически значимых вариантов, таких как группа крови у плода. Поскольку сфДНК составляет лишь небольшую часть циркулирующей ДНК, важно четко различать фетальные и материнские последовательности [20].
  • БВХ или амниоцентез
    • ПЦР может также использоваться для амплификации ДНК, выделенной из образцов, полученных при биопсии ворсин хориона (БВХ) или амниоцентезе. После ПЦР-амплификации продукты ПЦР обычно подвергаются секвенированию.
Тестирование на другие генетические вариации

ПЦР используется в других молекулярных тестах, особенно в тех, для которых известен конкретный патогенный вариант(ы). Для таких случаев можно разработать праймеры, которые будут амплифицировать только мутантную последовательность. Одним из таких примеров является определение варианта тромбофилии, связанного с фактором V Лейдена.

Применение в научных исследованиях

ПЦР широко используется в клинических и фундаментальных научных исследованиях.

Клинические исследования

ПЦР играет важную роль в исследованиях, формирующих новые гипотезы, например:

  • Различаются ли исходы у пациентов, чьи опухоли содержат определенный патогенный вариант?
  • Насколько вероятно, что пациент с определенным вариантом опухоли является носителем этого варианта в зародышевой линии?
  • Можно ли ускорить диагностику инфекционных заболеваний с помощью тестов на основе ДНК или РНК?
  • Обеспечивает ли лечение, основанное на молекулярной диагностике, лучшие результаты по сравнению с лечением, основанным на других методах диагностики, таких как бактериальный посев или гистопатологическое исследование?
  • Есть ли у пациента вариант, который является диагностическим критерием редкого заболевания?

Фундаментальные исследования

ПЦР широко применяется в исследовательской молекулярной биологии, практически любой эксперимент может включать этот метод. В качестве примера:

  • Анализ профиля экспрессии генов в опухолевой ДНК и прилегающей нормальной клеточной ДНК для выявления механизмов патогенеза или потенциальных мишеней для лекарственной терапии. Примером может служить открытие того, что в патогенезе саркомы Капоши участвует вирус, связанный с Herpes simplex [21-23].
  • Определение вирусной ДНК в опухолевых клетках для выявления ее патогенной роли.
  • Подтверждение редких вариантов, выявленных с помощью секвенирования нового поколения, путем амплификации специфических фрагментов с помощью ПЦР и последующего секвенирования по Сэнгеру. После подтверждения редкого варианта(ов) родственники могут быть протестированы с использованием ПЦР и секвенирования по Сэнгеру.
  • Генотипирование образцов ДНК у экспериментальных животных
Резюме
  • Теоретические основы
    • Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод быстрой и высокоспецифичной амплификации участка ДНК. Отличие ПЦР от предыдущих методов использования ДНК-полимеразы заключается в том, что полимераза в ПЦР может выдерживать высокие температуры, необходимые для расплавления двухцепочечной ДНК, что позволяет проводить экспоненциальную амплификацию без необходимости открывать пробирку и добавлять новую полимеразу. Этот метод был разработан в 1980-х годах и в 1993 году за его открытие была присуждена Нобелевская премия.
  • Процесс
    • Реакционная смесь содержит ДНК-матрицу (образец пациента), праймеры, определяющие область ДНК, которая должна быть амплифицирована, свободные нуклеотиды и термостабильную полимеразу. После того как реакционная смесь собрана, проводится трехэтапная обработка (денатурация, элонгация и отжиг), которая повторяется 30–40 раз в запрограммированном ПЦР-аппарате. Также может использоваться матрица РНК (например, вирусная), а для количественного анализа могут быть добавлены флуоресцентные зонды. Подбор праймеров и расчет температуры отжига можно выполнить с помощью специального программного обеспечения.
    • Необходимы положительные и отрицательные контрольные образцы для обеспечения достоверности теста.
  • Преимущества и недостатки
    • Преимущества ПЦР перед другими методами амплификации ДНК и другими видами анализов (посев на бактерии, гистологический анализ) включают быстрое время выполнения, высокую аналитическую чувствительность, низкую стоимость и возможность автоматизации. ПЦР не подходит для выявления новых последовательностей ДНК или новых микроорганизмов; для этих целей используется секвенирование ДНК нового поколения. Существует риск ложноположительных результатов из-за загрязнения образца посторонней ДНК. Частота ошибок возрастает с увеличением длины последовательностей. ПЦР не может отличить живые организмы от мертвых.
  • Клиническое применение
    • Инфекционные заболевания
      • ПЦР (полимеразная цепная реакция) может использоваться для выявления любого патогена (вирусного, бактериального, грибкового, протозойного) при условии, что известен хотя бы фрагмент его последовательности ДНК или РНК. В отношении большинства инфекционных заболеваний ПЦР более чувствительна, чем серологические исследования и посевы. ПЦР рутинно используется для диагностики COVID-19 или бессимптомной инфекции SARS-CoV-2. Клинические анализы с использованием мультиплексной ПЦР позволяют проводить исследование на несколько возможных возбудителей в одном и том же образце, например в секрете дыхательных путей или спинномозговой жидкости (СМЖ). ПЦР также используют для мониторинга вирусной нагрузки и скрининга донорской крови.
    • Онкологические заболевания
      • ПЦР можно проводить на биоптатах солидных опухолей или образцах крови. Этот метод широко используется в генетической диагностике рака, а также для мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) после лечения.
    • Акушерство
      • ПЦР необходима для проведения преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) и позволяет выявить свободную фетальную ДНК в материнской крови.
  • Исследования
    • ПЦР широко используется в клинических и фундаментальных научных исследованиях.
Список литературы
Переводчики:
Разделы:
Неврология Ревматология и ортопедия Инфекционные заболевания Гинекология (и акушерство) Фтизиатрия Гематология